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Eppendorf细胞培养耗材——提高光学检测性能,优化细胞显微成像

背景
使用倒置显微镜对细胞进行显微检测是细胞培养实验室的常规实验流程。细胞显微光学检测是非常重要的,如评估细胞融合情况,确认无污染产生。而且,许多培养板的细胞实验需要人工或自动化显微检测仪器来检测和分析。除仪器性能外,耗材对显微检测结果也会有很大影响:如半月形的液面会产生光波干涉,干扰了相差效果。即使反差度高的情况下细胞也很难聚焦,因此很难在小面积培养孔,如96孔板中采用此检测技术。此外,阴影干扰会减少可观察区域,培养表面不够平坦导致对焦次数增加。Eppendorf细胞培养耗材精细设计,培养表面非常平坦并减少半月形液面的产生,确保均匀照明,降低重复聚焦,保证出色的相差效果,因此实现快速、准确地细胞显微分析。

 

概述
使用倒置显微镜进行日常细胞分析是细胞处理过程非常重要的环节。无论是简单的常规操作—如快速检查细胞形态或单层细胞的融合度,还是复杂的细胞分析,快速、可靠的光学显微检测结果是细胞研究成功的关键。通常认为以下因素是获得有效显微分析结果的先决条件:观察区域尽可能少的重复聚焦次数;均匀照明,无阴影干扰;以及整个培养表面高相位差的细胞成像。除显微镜本身性能外,细胞培养耗材也从不同方面对操作流程和成像结果造成影响。

 

聚焦稳定性:
材料、底部厚度和外形设计都会影响细胞培养耗材表面的平坦度。比如玻璃便是一种具有良好硬度的材料,表面高度平坦,非常适于高分辨成像。而聚苯乙烯,细胞培养耗材的材料,硬度较低,因此与玻璃相比,其表面平坦度下降。底部不够平坦的耗材将导致重复对焦次数增加,使人工显微镜分析过程变得耗时、冗长。而且,重复性手动转动聚焦旋钮,以调节显微镜物镜到合适的焦平面,不利于人性化操作。特别是每天在显微镜下分析大量的细胞时,或者进行培养板内细胞显微镜检测时,这种工作就会变得更加单调乏味。使用自动显微镜系统,如用于细胞高内涵分析(HCA)可解决单调乏味的工作问题,但是基于激光的自动共聚焦系统意味着镜头需要重复对焦,造成分析时程增长,甚至结果更差,重复性更低。

 

半月形液面的形成和相差性能:
相差显微技术是最常见的相位差增强的光学显微技术,由于它可使透明的样品如活细胞产生明显的相位差,因此常用于细胞分析。相差显微技术常见问题是液体气-液表面半月形液面的形成。半月形液面会造成光线折射,使被检细胞很难展示出令人满意的相位差,因此该技术难以用于小面积培养孔,如96孔板的细胞检测。市面上有专门校准半月形液面效应的耗材[1],但常规细胞培养耗材的半月形液面几乎无法避免。除光学检测劣势—降低成像质量外,半月形液面通常还伴随着细胞生长的光圈效应:即相比中间区域,更多细胞贴壁于培养皿或培养板的外圈而形成环形圈。研究结果表明,当接种细胞或加入新培养基[2]时,培养基表面形成的半月形液面导致了这种细胞生长的不均匀状态。

 

成像区域的照明情况:
由于观察区域受限,孔边缘的阴影干扰是多孔培养板操作时的常见现象。它对细胞研究有不良影响,尤其是对整个生长区域都要求均匀照明的研究来说,如单细胞克隆实验:由于孔边缘的阴影干扰,培养孔外围细胞克隆的鉴定变得更难,甚至难以进行。

 

本篇应用文献中我们比较了Eppnedorf细胞培养耗材和其他品牌相对应耗材的光学性能:从平坦度、聚焦稳定性、相差成像质量和阴影形成四方面进行比较。

 

材料和方法
平坦度和聚焦稳定性:
通过光学扫描方法,对不同96孔聚苯乙烯细胞培养板整个表面的平坦度进行测定(n=4)。为了分析培养表面的聚焦稳定性,分别在Eppendorf 和其他两个品牌(品牌A,B)的100mm 细胞培养皿中接种相同密度的NIH 3T3细胞。接种48小时后,使用含10倍物镜的倒置显微镜观察细胞(Axio Observer A1,Zeiss)。培养皿中间区域的细胞聚焦观察后,然后移动培养皿观察其他几个细胞生长区域,但未重新对焦。每个培养皿选取三个不同点拍照,比较不同点的细胞是否都焦距范围内。

 

相差显微性能:
为了检测半月形液面对倒置相差显微镜的影响,CHO-K1细胞以相同密度接种至不同96孔细胞培养板上。接种48小时后,分别以含20倍和40倍物镜的相差显微镜检测分析96孔细胞培养板 (CKX41, Olympus)。

 

成像区域照明:
通过显微分析研究,比较了不同96孔细胞培养板每个孔边缘的光学照明。96孔细胞培养板分别接种相同密度的脂肪间充质干细胞(AdMSCs)。细胞生长5天后,首先通过倒置相差显微镜(CK40,Olympus)观察,然后DAPI(细胞核)染色,并在荧光显微镜下分析(Life Technologies,EVOSL,Thermo Fisher Scientific)。

 

结果和讨论
平坦度和聚焦稳定性:
细胞生长表面的聚焦稳定性跟耗材表面的平坦度有很大关联。平坦度高的表面可以减少重复对焦次数。如图1所示,Eppendorf细胞培养皿三个观察点的细胞都展示出清晰的、聚焦的高反差图片,几乎不需要重复对焦。然而测试的其他品牌的细胞培养皿,当对焦后从皿中间区域移到其他区域时,不调节物镜焦距就会产生模糊的、没有对焦的图片。出色的聚焦稳定性说明了Eppendorf细胞培养耗材的底部具有更好的平坦性。

 

光学扫描分析结果表明,相比其他品牌的细胞培养板,Eppendorf 96孔细胞培养板整个孔底表面具有最好的平坦度(见图2)。

 

 

半月形液面和相差显微性能: 
图3显示Eppendorf 96 孔细胞培养板孔内溶液的半月形液面能降低到最小。半月形液面的产生是由于细胞培养耗材表面经组织处理,使得原本疏水性的聚苯乙烯变成亲水性表面。

 

 

Eppendorf细胞培养耗材组织处理(TC)表面产品,采用标准、成熟的处理技术,即电晕处理。该处理过程给原本疏水性聚苯乙烯表面引入带电基团,有助于绝大多数贴壁细胞的贴壁和生长。但不同于其他品牌的绝大部分产品,Eppendorf 使用独特技术,仅使孔底表面经过TC处理,而培养孔侧面仍然保持疏水性。这种独特处理技术确保Eppendorf 细胞培养耗材很少产生半月形液面,并提高光学检测结果。

 

为了评估半月形液面对相差显微镜成像结果的影响,细胞接种在96 孔细胞培养板上,然后分别使用20倍和40倍物镜,在倒置显微镜上通过相差显微技术观察分析。

 

 

 

 

正如图4所示,Eppendorf细胞培养板在所有不同放大倍数下都具有很好的相差成像结果。Eppendorf细胞培养板的每个细胞在两种放大倍数下都清晰成像且相差反差明显,然而其他品牌同样规格细胞培养板的细胞成像清晰度差,且难对焦。半月形液面造成光学干扰,从而影响相差显微成像效果(见图 5a)。半月形液面的消除能防止光线折射,保证均一的背景照明,和良好的相差显微成像效果(见图 5b),因此整个观察区域都具有出色的相差显微性能。

 

 

成像区域的照明情况:
通过相差和荧光显微技术,比较不同96 孔细胞培养板孔底部边缘的照明情况。Eppendorf培养板孔底无阴影产生,不会干扰显微成像或眼睛直接观察 。不同的是,两种其他品牌培养板的孔底均有黑色阴影圈产生,缩减了可观察区域,因此对光学或荧光显微镜检测造成干扰(见图6)。由于Eppendorf细胞培养板减少了半月形液面,而且具有精准的孔形设计,因此培养孔具有均匀的照明性能。
 

 

结论
高效的显微分析技术对细胞研究非常重要,从常规基本的细胞形态观察,直至基于细胞的检测分析。Eppendorf细胞培养耗材显示出优化的显微检测性能:出色的底部平坦性,几乎无需重复对焦,加快实验流程。精准的孔形设计和减少的半月形液面,确保孔边缘均匀照明,无阴影干扰;并提高整个观察区域的相位差。拥有如此的优势性能,Eppendorf 细胞培养耗材将会成为显微镜分析和检测的最适伙伴。

 

参考文献
[1] Horn E, Zantl, R. Phase-contrast light microscopy of living cells cultured in small volumes. Microscopy and Analysis.
May 2006; 5–7.
[2] Ryan J.A. American biotechnology laboratory. 1989 7(1):8–16