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用Eppendorf的InjectMan 4显微操作系统进行植物幼苗细胞显微注射

Tim Kunkel, Albert-Ludwigs-University, Faculty of Biology,
Institute of Biology II, Schänzlestr.1, 79104 Freiburg, Germany

 

简介:
许多年前,Chua和合作者为了解光信号级联反应中作用,进行了”高等”植物的显微注射,早期的研究人员用了许多可能的样品与DNA,蛋白和如GTPγS[1]细胞作用子进行共注射,在这些研究中,在注射了红色的/深红色的光感受器光敏色素后可以观察到原生质体发育和花青素生成等细胞反应。然而大细胞水藻和植物原生质体的注射容易学习,单植物细胞亚细胞器的注射比较困难,通常植物细胞有非常硬的壁,对显微注射当然是一个问题,因为这需要小口径的注射针足够硬,植物细胞的膨胀程度非常高,不仅对苗形态有影响,而且在发育中发挥了重要的作用[2]。即便抵消细胞内压的注射是成功的,当针撤出细胞时,对大细胞壁的损伤会自动导致细胞的死亡。植物细胞的中央滤泡也是一个问题,环绕在中央滤泡周围的胞浆只有几个µm薄,会降低胞浆注射的成功率,注射过程中细胞壁的损伤和操作针穿透细胞壁时的突然松驰,针经常会在滤泡上方出现问题。注射入滤泡的样品不仅会使细胞变大,而且在许多情况下产生pH值降低和许多蛋白酶激活而产生问题,而且,对于环绕在滤泡外的单层滤泡膜,容易注射的同时也导致了细胞毒性物质漏入了胞浆内,因此导致细胞死亡。

 

而且,因为多细胞层,光散射,色素沉着, 整个植物苗或植物器官的光学特性并不是最佳,因此,在显微注射过程中,在显微镜下分辨不同的细胞层或亚细胞结构,如滤泡等经常是困难的。

 

为了解决这些问题,Eppendorf 开发出了一套显微操作系统,它的微电机非常快,注射参数可以调整,高的固定和注射压力,同时结合了新增出来的压电步进功能,下文介绍了使用这一合适系统成功进行植物细胞注射的测试。

 

方法:

准备:苗放在湿滤纸上,发芽后在持续的黑暗中按各种不同的次数培养(Sinapis alba 4 dD, Lycopersicon esculentum 6 dD, Arabidopsis thaliana 4 dD),拟南芥发芽后冷处理(4°C)感应2天,随后在白光下照射6小时,注射前苗放在一个培养皿的盖子中,根部用湿滤纸盖上,用胶带固定(图1B),为了防止风机的震动,在层流净化罩中的石台上进行显微注射。显微注射针用外径1.5mm,各种内径(1.2-0.89mm)硼硅酸玻璃针胚,在垂直拉针仪上拉制。在Ethanol进行压力测试针口大小[3]

 

注射:显微注射工作站配置如下:Eppendorf显微操作仪InjectMan 4装在Zeiss Axiovert® 135倒置显微镜上。Eppendorf 的PiezoXpert压电式破膜仪的驱动元件以35度角装在InjectMan 4的驱动马达上,为启动压电辅助的注射步骤,PiezoXpert与InjectMan 4 以数据线相连。以InjectMan 4操作面板上显示的速度至少3000 µm/s,注射路程10-20 µm(根据样品大小)自动斜行注射。在PiezoXpert上设定压电脉冲参数,振幅最大(强度:50)频率(速度:40)和脉冲次数(次数:无穷大)。在Eppendorf 的FemtoJet微量自动注射仪上调整注射压力的参数,注射压力的参数设置如表1,成功地突破细胞壁后启动注射压力。整个的配置如图1 。在注射前通过超滤仪过滤注射液 (染料:荧光黄 (ly), 0.2 mg/mL;蛋白: Alexa Fluor 488-标记组蛋白, 2 mg/mL),用Eppendorf 的Microloader微量上样针直接给注射针加样。

 

 

表1:将荧光黄(ly) 和 Alexa Fluor 488-标记组蛋白(组蛋白)显微注射入蕃茄,芥茉和拟南芥幼苗。注射前的平衡压力(Pc),注射压力(Pi),注射时间(Ti)。

 

幼苗

注射参数设置

 

 

注射针开口µm

注射液

注射细胞数

阳性细胞率(数量)

 

Pi(hPa)

Ti(s)

Pc(hPa)

 

 

 

 

芥兰

2000

0.2

800

0.8

荧光黄

27

26%(7)

蕃茄

2400

0.3-0.6

1200

0.2-0.5

荧光黄

25

48%(12)

拟南芥

2400

0.6

840

0.2-0.5

荧光黄

34

11%(4)

芥兰

2400

0.5

1200

0.3-0.4

组蛋白

43

23%(10)

拟南芥

2400

0.5

1000

0.3-0.4

组蛋白

15

26%(4)

 

 

结果与讨论
为了检测这套新的Eppendorf显微操作系统可用于植物细胞注射,以注射角度设置35度,注射步进10-20 µm设置注射动作,这样的参数设置可以降低对细胞壁的损伤,保证注射后尽可能地提高存活率。当两个设置,InjectMan 4与PiezoXpert通过数据线相连时,压电脉冲可以同时伴随注射动作进行。荧光黄作为注射标记物,如前介绍注射后(如表1),这种水溶性的染料易于辨识标记了的细胞膜与液泡间位置,每个幼苗子叶下轴注射5-8次,注射后的幼苗立即用双蒸水清洗,除去幼苗上因断针或注射后细胞损伤等原因留下的荧光黄等。注射后24小时用Zeiss的YFP或 GFP滤片观察结果,在这些实验中用了蕃茄,芥兰和拟南芥,表1中的细胞阳性标记物出现在胞浆或液泡中。其中,蕃茄和芥兰幼苗注射观察到的成功率分别为26%和48%,如图2,注射24小时后,拟南芥的注射成功率在10%,与蕃茄和芥兰比,拟南芥幼苗的注射成功率大大不如,因为拟南芥的幼苗更加小更加柔软,而注射的细胞不仅相对干,而且许多情况下注射时整个子叶下轴都受影响,考虑到这些情况,我们认为对于拟南芥幼苗,10%的成功率已经不错了。

 

注射后24小时可以见到荧光黄(ly)荧光标记的细胞,但荧光黄并不是一种活体标记物,因此,我们决定用Alexa Fluor 488-标记的组蛋白(组蛋白-AF488)来进行注射,注射入细胞浆后,组蛋白可以被运输入细胞核,并在核内累积,这种组蛋白运输入核上一个主动的过程,需要GTPT 和整套蛋白复合物。因此,组蛋白-AF488应该只发生在活细胞内[4],表1显示组蛋白-AF488的成功率与荧光黄(ly)的成功率在一个水平,证明这些细胞在注射过程中是活的。虽然在注射过的细胞核中明确观察到了组蛋白-AF488,在个别的情况下,附近的细胞核也有组蛋白荧光(图2,左下角图),以往的资料解释,这是通过胞间连接,在病毒DNA等复合物中进行了组蛋白运输造成这一现象的[5]

 

综合以上,因为马达运动速度快且精准,Eppendorf的显微操作系统用于植物细胞注射非常合适,这也包括相对高效率地进行拟南芥幼苗的注射,因此通过显微注射从特殊组织或器官中得到的拟南芥细胞,应该可以大量地得到许多用于研究领域的拟南芥突变和转基因株,除此之外,还可以注射别的植物品种,来帮助分析许多科学问题。

 

致谢

我感谢Dr. Stefan Kircher 和 Prof. Eberhard Schäfer,因为他们的支持与科学地讨论。

 

参考文献

[1] Neuhaus G, Bowler C, Kern R, Chua NH. Calcium/Calmodulin-dependent and -independent phytochrome signal
transduction pathways. Cell 1993; 73:937-952.
[2] Sampathkumar A, Yan A, Krupinski P, Meyerowitz EM. Physical forces regulate plant development and morphogenesis.
Current Biol 2014; 24:475-483.
[3] Schnorf M, Potrykus I, Neuhaus G. Microinjection technique: Routine system for characterization of microcapillaries by
bubble pressure measurement. Exp Cell Res 1994; 210:260-267.
[4] Melchior F, Paschal B, Evans J and Gerace L. Inhibition of nuclear protein import by nonhydrolyzable analogues of GTP
and identification of the small GTPase Ran/TC4 as an essential transport factor. J Cell Biol 1993; 123:1649-1659.
[5] Zhou Y, Rojas MR, Park MR, Seo YS, Lucas WJ, Gilbertson RL. Histone H3 interacts and colocalizes with the nuclear
shuttle protein and the movement protein of a geminivirus. J Virol 2011; 85:11821-32.